Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

 

Tras extraer y obtener el ADN de la muestra, el siguiente paso en cualquier análisis genético es la selección y amplificación de la región del genoma que queremos estudiar. Para ello, es necesario unos cebadores o primers que acoten nuestra región de interés y una enzima polimerasa que se encargue de replicar (hacer miles de copias) ese fragmento del genoma.

 

1. ¿QUÉ ES LA PCR?

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una de las técnicas más comunes en un laboratorio de genética y cuya finalidad es la de obtener muchas copias de una región concreta del ADN. Estudiar una región de ADN puede ser interesante para conocer la función de un gen, analizar un marcador genético que nos permita identificar a una persona o un gen en el que queremos encontrar una mutación que produzca una determinada enfermedad.

Por tanto, el objetivo final de la PCR es producir suficiente cantidad de ADN, de la región de interés, para que pueda analizarse o usarse en alguna otra técnica: por ejemplo, para secuenciación, para visualizar por electroforesis en gel o para realizar una restricción enzimática.

 

2. COMPONENTES DE UNA PCR

Para realizar la amplificación del genoma mediante una PCR existen una serie de componentes básicos, entre los que encontramos:

  1. Muestra de ADN.
  2. Cebadores o primers.
  3. Enzima polimerasa (Taq polimerasa).
  4. Medio estable para que se produzca la reacción.
  5. Solución de nucleótidos que empleará la enzima para poder realizar copias del genoma junto con los cofactores que necesite dicha enzima.

 

3. TAQ POLIMERASA

Al igual que ocurre en la replicación del ADN en las células de un organismo, la PCR requiere de una enzima ADN polimerasa que produzca nuevas cadenas de ADN mediante el uso de las cadenas existentes como molde.

Sin embargo, esta enzima debe poseer unas características especiales: que soporte bien el incremento de temperatura. El proceso de amplificación se lleva a cabo en ciclos, en cada uno de los cuales es necesario incrementar la temperatura (96ºC) para conseguir desnaturalizar y separar las hebras de ADN, sin desnaturalizar las proteínas. Además, es necesario que el proceso de síntesis de nuevas cadenas de ADN se realice a una temperatura elevada (en torno a 72ºC) para evitar que las cadenas vuelvan a unirse en mitad del proceso. Por estos motivos se hace necesaria la utilización de una enzima capaz de soportar y trabajar a altas temperaturas. La ADN polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa, la cual debe su nombre a la bacteria hipertermófila de la que se aisló (Thermus aquaticus). El hábitat natural de esta bacteria son la fumarolas y fuentes hidrotermales, por este motivo, su ADN polimerasa es muy termoestable y su mayor actividad se presenta cerca de los 70°C (temperatura a la cual la ADN polimerasa del ser humano no funcionaría).

 

4. CEBADORES O PRIMERS

Los cebadores o primers son fragmentos cortos de ADN de cadena sencilla (generalmente de unos 20 nucleótidos de longitud) y cuya función es la de acotar la región del genoma que queremos amplificar, ya que sirven como punto de partida para la ADN polimerasa. Estos primers deben ser diseñados de tal forma que su secuencia sea la complementaria a la región previa de la que queremos amplificar, esto permitirá la unión por complementariedad de bases y servirá como punto de partida para la ADN polimerasa, todo ello lo podemos observar en la siguiente figura (Figura 1).

 

5. PASOS DE LA PCR

Una vez hemos analizado las partes que componen la reacción en cadena de la polimerasa, vamos a enumerar los pasos principales que se suceden en cada ciclo de la reacción:

  1. Desnaturalización: en este paso subimos la temperatura hasta los 96ºC para favorecer la separación, o desnaturalización, de las cadenas de ADN. Esto nos proporciona las hebras de cadena sencilla que servirán de molde para el siguiente paso.

 

  1. Templado o anillamiento: la temperatura disminuye hasta los 55-65ºC (dependiendo de la temperatura de anillamiento específica de cada primer) para permitir que los primers puedan unirse a sus secuencias complementarias en la hebra molde de ADN.

 

  1. Elongación: es el paso final del ciclo, en el que la temperatura de la reacción se eleva entorno a los 72ºC para favorecer así la actividad de la enzima Taq Esta procederá a extender los primers y sintetizar así nuevas cadenas de ADN.

 

Este ciclo se repite entre 25-45 veces en una reacción completa de PCR, lo que nos permite obtener en cada ciclo un número exponencial de copias de la región que queremos estudiar, hasta obtener millones de copias de la región de interés (Figura 2).

 

 

6. BIBLIOGRAFÍA

 

Jesús Viñas López – Genyca

Extracción casera de ADN

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1.  INTRODUCCIÓN

A pesar de lo que la mayoría pudiera pensar, la extracción de ADN es un proceso simple que, con el debido procedimiento, podemos realizar en la cocina de cualquier casa.

Al igual que la extracción en el laboratorio, para obtener el material genético se requiere de una serie de etapas básicas. En primer lugar, debemos conseguir lisar o romper la pared celular y/o la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula dónde se encuentra alojado el ADN. A continuación, debe romperse de igual forma la membrana nuclear para dejarlo libre. Una vez liberado, hay que proteger el ADN de enzimas y otros componentes celulares que puedan dañarlo. Y finalmente, se debe precipitar en un medio estable.

2.  OBJETIVOS 

  • Reflexionar sobre la sencillez del proceso de extracción de ADN.
  • Establecer un protocolo que nos permita obtener ADN mediante elementos cotidianos.

 

3.  MATERIAL NECESARIO

  • Muestra a extraer
  • Sal de mesa
  • Lavavajillas o detergente líquido
  • Alcohol 96º
  • Agua destilada o mineral
  • Vasos
  • Una cuchara sopera
  • Una varilla fina

 

4.  PROCEDIMIENTO

  • En primer lugar, debemos obtener una muestra a partir de la cual poder obtener ADN. En este ensayo vamos a emplear nuestro propio ADN, para ello debemos enjuagarnos la boca con agua durante 30-40 segundos y verter el enjuague de nuevo en el vaso.

 

  • A continuación, procederemos a preparar las diluciones que emplearemos más adelante. Por un lado, debemos verter en un vaso unas 5 cucharadas soperas (unos 120 ml) de agua destilada o mineral junto con media cucharada sopera de sal común y remover hasta disolver la sal. En otro vaso, mezclaremos una cucharada de lavavajillas o detergente líquido junto a 3 cucharadas de agua destilada o mineral.

 

  • Tras preparar las disoluciones, añadiremos dos cucharadas de zumo de piña al enjuague y removemos para homogenizar.

 

  • Una vez preparado todo, añadiremos una cucharada sopera de la solución salina y otra de la mezcla del lavavajillas al vaso dónde se encuentra nuestro enjuague junto con el zumo de piña.

 

  • Para finalizar el proceso procederemos a añadir el alcohol (el doble de volumen de alcohol que de mezcla), para ello es muy IMPORTANTE que vertamos dicho alcohol lentamente por las paredes del vaso para evitar que se mezcle y conseguir dos capas bien diferenciadas, ya que será en esta separación entre la capa de mezcla y de alcohol dónde precipite el ADN.

 

  • Tras dejarlo reposar unos minutos, veremos como van apareciendo en esa interfase pequeños hilos o fibras blanquecinas (nuestro ADN). Para poder extraerlo con facilidad, emplearemos una varilla fina.

 5. MARCO TEÓRICO

¿Para qué sirve la disolución salina que ponemos en la mezcla?

La sal en disolución actúa disminuyendo la solubilidad de las proteínas, lo que hace que precipiten y se separen más fácilmente del ADN para poder obtenerlo con una mayor pureza.

 

¿Para qué utilizamos el lavavajillas?

El detergente líquido o el lavavajillas utilizado en el experimento tiene como función destruir las membranas celulares del tejido vivo que estamos utilizando. El detergente disuelve las grasas o lípidos, que es el componente principal de la membrana plasmática y nuclear de las células (es el mismo principio por el que el gel limpia la grasa de nuestra piel). Al romperse las membranas celulares se permite la salida del ADN al exterior.

 

¿Para qué se utiliza el alcohol?

El ADN es una molécula muy larga y tiende agruparse, de ahí la facilidad para retirarla. Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en alcohol, ya que el ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol precipita. Por este motivo, nuestras hebras de ADN comienzan a hacerse visibles en la interfase entre la mezcla y el alcohol.

Además de permitirnos distinguirlo, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales quedan en la solución acuosa.

 

¿Para qué se añade el zumo de piña?

El zumo de piña contiene una enzima denominada papaína. Esta enzima se encarga de atacar y degradar el resto de proteínas y componentes celulares, lo que nos permite separarlos del material que buscamos, nuestro ADN.

 

6. BIBLIOGRAFÍA

 

Jesús Viñas López – Genyca