Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

 

Tras extraer y obtener el ADN de la muestra, el siguiente paso en cualquier análisis genético es la selección y amplificación de la región del genoma que queremos estudiar. Para ello, es necesario unos cebadores o primers que acoten nuestra región de interés y una enzima polimerasa que se encargue de replicar (hacer miles de copias) ese fragmento del genoma.

 

1. ¿QUÉ ES LA PCR?

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una de las técnicas más comunes en un laboratorio de genética y cuya finalidad es la de obtener muchas copias de una región concreta del ADN. Estudiar una región de ADN puede ser interesante para conocer la función de un gen, analizar un marcador genético que nos permita identificar a una persona o un gen en el que queremos encontrar una mutación que produzca una determinada enfermedad.

Por tanto, el objetivo final de la PCR es producir suficiente cantidad de ADN, de la región de interés, para que pueda analizarse o usarse en alguna otra técnica: por ejemplo, para secuenciación, para visualizar por electroforesis en gel o para realizar una restricción enzimática.

 

2. COMPONENTES DE UNA PCR

Para realizar la amplificación del genoma mediante una PCR existen una serie de componentes básicos, entre los que encontramos:

  1. Muestra de ADN.
  2. Cebadores o primers.
  3. Enzima polimerasa (Taq polimerasa).
  4. Medio estable para que se produzca la reacción.
  5. Solución de nucleótidos que empleará la enzima para poder realizar copias del genoma junto con los cofactores que necesite dicha enzima.

 

3. TAQ POLIMERASA

Al igual que ocurre en la replicación del ADN en las células de un organismo, la PCR requiere de una enzima ADN polimerasa que produzca nuevas cadenas de ADN mediante el uso de las cadenas existentes como molde.

Sin embargo, esta enzima debe poseer unas características especiales: que soporte bien el incremento de temperatura. El proceso de amplificación se lleva a cabo en ciclos, en cada uno de los cuales es necesario incrementar la temperatura (96ºC) para conseguir desnaturalizar y separar las hebras de ADN, sin desnaturalizar las proteínas. Además, es necesario que el proceso de síntesis de nuevas cadenas de ADN se realice a una temperatura elevada (en torno a 72ºC) para evitar que las cadenas vuelvan a unirse en mitad del proceso. Por estos motivos se hace necesaria la utilización de una enzima capaz de soportar y trabajar a altas temperaturas. La ADN polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa, la cual debe su nombre a la bacteria hipertermófila de la que se aisló (Thermus aquaticus). El hábitat natural de esta bacteria son la fumarolas y fuentes hidrotermales, por este motivo, su ADN polimerasa es muy termoestable y su mayor actividad se presenta cerca de los 70°C (temperatura a la cual la ADN polimerasa del ser humano no funcionaría).

 

4. CEBADORES O PRIMERS

Los cebadores o primers son fragmentos cortos de ADN de cadena sencilla (generalmente de unos 20 nucleótidos de longitud) y cuya función es la de acotar la región del genoma que queremos amplificar, ya que sirven como punto de partida para la ADN polimerasa. Estos primers deben ser diseñados de tal forma que su secuencia sea la complementaria a la región previa de la que queremos amplificar, esto permitirá la unión por complementariedad de bases y servirá como punto de partida para la ADN polimerasa, todo ello lo podemos observar en la siguiente figura (Figura 1).

 

5. PASOS DE LA PCR

Una vez hemos analizado las partes que componen la reacción en cadena de la polimerasa, vamos a enumerar los pasos principales que se suceden en cada ciclo de la reacción:

  1. Desnaturalización: en este paso subimos la temperatura hasta los 96ºC para favorecer la separación, o desnaturalización, de las cadenas de ADN. Esto nos proporciona las hebras de cadena sencilla que servirán de molde para el siguiente paso.

 

  1. Templado o anillamiento: la temperatura disminuye hasta los 55-65ºC (dependiendo de la temperatura de anillamiento específica de cada primer) para permitir que los primers puedan unirse a sus secuencias complementarias en la hebra molde de ADN.

 

  1. Elongación: es el paso final del ciclo, en el que la temperatura de la reacción se eleva entorno a los 72ºC para favorecer así la actividad de la enzima Taq Esta procederá a extender los primers y sintetizar así nuevas cadenas de ADN.

 

Este ciclo se repite entre 25-45 veces en una reacción completa de PCR, lo que nos permite obtener en cada ciclo un número exponencial de copias de la región que queremos estudiar, hasta obtener millones de copias de la región de interés (Figura 2).

 

 

6. BIBLIOGRAFÍA

 

Jesús Viñas López – Genyca

Día Mundial del ADN

El día 25 de abril se celebra en todo el mundo el Día del ADN en conmemoración a la fecha de publicación en Nature del artículo en el que James Watson y Francis Crick presentaron el modelo de la estructura en doble hélice del ADN.

Para sacar las conclusiones que les llevaron a determinar la estructura, así como el giro de la doble hélice, fueron clave las investigaciones de Rosalind Franklin, concretamente la “Fotografía número 51” de Rayos X.

El establecimiento de la estructura del ADN fue uno de los grandes avances del siglo XX y permitió el descubrimiento del código genético. Además, gracias a este descubrimiento se pudo comprender cómo se comporta el material genético de generación en generación y entender el origen de muchas enfermedades hereditarias.

Como reconocimiento a sus trabajos sobre la molécula del ADN, Watson, y Crick junto a Wilkins recibieron en 1962 el Premio Nobel de Fisiología y Medicina.

Extracción casera de ADN

Si quieres poner en práctica de forma educativa otras técnicas de estudio de ADN  pincha aquí

1.  INTRODUCCIÓN

A pesar de lo que la mayoría pudiera pensar, la extracción de ADN es un proceso simple que, con el debido procedimiento, podemos realizar en la cocina de cualquier casa.

Al igual que la extracción en el laboratorio, para obtener el material genético se requiere de una serie de etapas básicas. En primer lugar, debemos conseguir lisar o romper la pared celular y/o la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula dónde se encuentra alojado el ADN. A continuación, debe romperse de igual forma la membrana nuclear para dejarlo libre. Una vez liberado, hay que proteger el ADN de enzimas y otros componentes celulares que puedan dañarlo. Y finalmente, se debe precipitar en un medio estable.

2.  OBJETIVOS 

  • Reflexionar sobre la sencillez del proceso de extracción de ADN.
  • Establecer un protocolo que nos permita obtener ADN mediante elementos cotidianos.

 

3.  MATERIAL NECESARIO

  • Muestra a extraer
  • Sal de mesa
  • Lavavajillas o detergente líquido
  • Alcohol 96º
  • Agua destilada o mineral
  • Vasos
  • Una cuchara sopera
  • Una varilla fina

 

4.  PROCEDIMIENTO

  • En primer lugar, debemos obtener una muestra a partir de la cual poder obtener ADN. En este ensayo vamos a emplear nuestro propio ADN, para ello debemos enjuagarnos la boca con agua durante 30-40 segundos y verter el enjuague de nuevo en el vaso.

 

  • A continuación, procederemos a preparar las diluciones que emplearemos más adelante. Por un lado, debemos verter en un vaso unas 5 cucharadas soperas (unos 120 ml) de agua destilada o mineral junto con media cucharada sopera de sal común y remover hasta disolver la sal. En otro vaso, mezclaremos una cucharada de lavavajillas o detergente líquido junto a 3 cucharadas de agua destilada o mineral.

 

  • Tras preparar las disoluciones, añadiremos dos cucharadas de zumo de piña al enjuague y removemos para homogenizar.

 

  • Una vez preparado todo, añadiremos una cucharada sopera de la solución salina y otra de la mezcla del lavavajillas al vaso dónde se encuentra nuestro enjuague junto con el zumo de piña.

 

  • Para finalizar el proceso procederemos a añadir el alcohol (el doble de volumen de alcohol que de mezcla), para ello es muy IMPORTANTE que vertamos dicho alcohol lentamente por las paredes del vaso para evitar que se mezcle y conseguir dos capas bien diferenciadas, ya que será en esta separación entre la capa de mezcla y de alcohol dónde precipite el ADN.

 

  • Tras dejarlo reposar unos minutos, veremos como van apareciendo en esa interfase pequeños hilos o fibras blanquecinas (nuestro ADN). Para poder extraerlo con facilidad, emplearemos una varilla fina.

 5. MARCO TEÓRICO

¿Para qué sirve la disolución salina que ponemos en la mezcla?

La sal en disolución actúa disminuyendo la solubilidad de las proteínas, lo que hace que precipiten y se separen más fácilmente del ADN para poder obtenerlo con una mayor pureza.

 

¿Para qué utilizamos el lavavajillas?

El detergente líquido o el lavavajillas utilizado en el experimento tiene como función destruir las membranas celulares del tejido vivo que estamos utilizando. El detergente disuelve las grasas o lípidos, que es el componente principal de la membrana plasmática y nuclear de las células (es el mismo principio por el que el gel limpia la grasa de nuestra piel). Al romperse las membranas celulares se permite la salida del ADN al exterior.

 

¿Para qué se utiliza el alcohol?

El ADN es una molécula muy larga y tiende agruparse, de ahí la facilidad para retirarla. Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en alcohol, ya que el ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol precipita. Por este motivo, nuestras hebras de ADN comienzan a hacerse visibles en la interfase entre la mezcla y el alcohol.

Además de permitirnos distinguirlo, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales quedan en la solución acuosa.

 

¿Para qué se añade el zumo de piña?

El zumo de piña contiene una enzima denominada papaína. Esta enzima se encarga de atacar y degradar el resto de proteínas y componentes celulares, lo que nos permite separarlos del material que buscamos, nuestro ADN.

 

6. BIBLIOGRAFÍA

 

Jesús Viñas López – Genyca

Concurso Día del ADN 2018: “ADN ERES TÚ”

BASES CONCURSO “ADN ERES TÚ”, DÍA del ADN – 25 de abril 2018

Bases descargables del concurso “ADN eres tú” 2018.

  1. PRESENTACIÓN

Con el motivo del Día del ADN, que se celebra mundialmente el 25 de abril, se propone esta actividad, organizada por GENYCA INNOVA SL, con el fin de promover la Biología Molecular, fomentar la creatividad y el trabajo en equipo de una forma entretenida.

 

  1. PERSONAS A LAS QUE SE DIRIGE EL CONCURSO

El concurso está abierto a todo el alumnado de institutos de Formación Profesional que esté cursando Anatomía Patológica y Citodiagnóstico y Laboratorio Clínico y Biomédico.

Se entenderá por concursante el profesor/tutor responsable del grupo participante y cada uno de los alumnos. Cada grupo participante deberá incluir obligatoriamente al profesor/tutor de la asignatura.

Se entenderá por portavoz el representante de cada grupo de alumnos, que será el encargado de subir la fotografía al concurso.

 

  1. MECÁNICA DE PARTICIPACIÓN Y PREMIOS
  • El concurso consiste en presentar una fotografía con temática inspirada en el ADN, la Biología Molecular o sus aplicaciones (Genética Forense, diagnóstico genético, etc.), formada por los integrantes del grupo de alumnos participante.

Ejemplo: una figura humana de doce personas formando la doble hélice de ADN, una escena de una película donde el ADN sea el protagonista,…

  • El concurso se celebrará a través del evento del Facebook de Aula GENYCA titulado «Concurso GENYCA Día del ADN 2018» donde el portavoz publicará la fotografía. El portavoz, además, deberá ser seguidor de Aula GENYCA en Facebook (@aulagenyca) y en Instagram (@aula.genyca).

 

  • La fotografía irá acompañada de:
  • Los hashtag #AulaGenyca #ADNEresTu #DiaDelADN2018
  • Título de la fotografía.
  • Descripción de la imagen representada (qué significa la forma, los colores que llevan las personas, etc.)
  • Nombre del instituto y nombre de la titulación específica que estén cursando.

 

  • Los concursantes deberán inscribirse rellenando el siguiente formulario:

https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSecR9W-UpHdhW_PLQmjCuqiIXDXW-w-Nzb3cxDEvA0yIAhWbA/viewform

  • El número de personas que participen en la figura no está limitado (solo limitado por el número de personas del grupo).
  • El número de fotografías que cada instituto puede presentar en el concurso no está limitado.
  • Se entregará un Certificado de Compromiso con la Divulgación Científica a cada centro participante.
  • Ganará el concurso la fotografía que muestre más «Me gusta» en Facebook. Cada participante deberá haberse inscrito previamente para poder recibir el premio.
  • El premio consistirá en
    • Premio al centro/instituto: juego de micropipetas + cajas de puntas + gradillas.
    • Premio a cada participante inscrito del centro ganador: una taza con la fotografía ganadora impresa en ella + Curso online de especialización en Biología Molecular + Diploma de Participación en el Día del ADN
    • Premio al profesor/tutor representante inscrito del grupo ganador: Curso online de especialización en Biología Molecular + Diploma de Participación en el Día del ADN

 

  1. FECHA DEL CONCURSO

El plazo para la publicación de las fotografías comienza el 1 de abril y tiene como fecha límite el 24 de abril a las 23:59h.

 

  1. ANUNCIO DE LOS PREMIADOS Y ENTREGA DEL PREMIO

El ganador del concurso se hará público el mismo 25 de abril en el perfil de Facebook de Aula GENYCA. Además, contactaremos directamente con el ganador a través del correo electrónico y teléfono proporcionados en el Anexo I.

 

  1. RESPONSABILIDAD DE LA EMPRESA

El portavoz debe tener los derechos/propiedad intelectual de la imagen que publica, poseer el permiso de todos los fotografiados, y la imagen no debe contener nada que la ley impida su libre difusión. GENYCA no se hace responsable de posibles violaciones de derechos de imagen/propiedad intelectual de las fotografías publicadas en el concurso. GENYCA podrá utilizar las imágenes participantes, con el fin de promocionar este concurso en la presente y sucesivas convocatorias y hacer un resumen del mismo en la web de GENYCA y Aula GENYCA y en sus redes sociales.

 

  1. TRATAMIENTO DE LOS DATOS PERSONALES

De conformidad con lo establecido en la normativa vigente en Protección de Datos de Carácter Personal, le informamos que sus datos serán incorporados al sistema de tratamiento titularidad de GENYCA INNOVA SL con CIF B83751933 y domicilio social sito en C/ ALEGRIA, 18 28220, MAJADAHONDA (MADRID), con la finalidad organizar el presente concurso y remitirle información relacionada que pueda ser de su interés. En cumplimiento con la normativa vigente, GENYCA INNOVA SL informa que los datos serán conservados durante el plazo estrictamente necesario para cumplir con los preceptos mencionados con anterioridad.

Mientras no nos comunique lo contrario, entenderemos que sus datos no han sido modificados, que usted se compromete a notificarnos cualquier variación y que tenemos su consentimiento para utilizarlos para las finalidades mencionadas.

GENYCA INNOVA SL informa que procederá a tratar los datos de manera lícita, leal, transparente, adecuada, pertinente, limitada, exacta y actualizada. Es por ello que GENYCA INNOVA SL se compromete a adoptar todas las medidas razonables para que estos se supriman o rectifiquen sin dilación cuando sean inexactos.

De acuerdo con los derechos que le confiere el la normativa vigente en protección de datos podrá ejercer los derechos de acceso, rectificación, limitación de tratamiento, supresión, portabilidad y oposición al tratamiento de sus datos de carácter personal así como del consentimiento prestado para el tratamiento de los mismos, dirigiendo su petición a la dirección postal indicada más arriba o al correo electrónico RCASARES@GENYCA.ES.

A su vez, le informamos que puede contactar con el Delegado de Protección de Datos de GENYCA INNOVA SL, dirigiéndose por escrito a la dirección de correo dpo.cliente@conversia.es o al teléfono 902877192.

Podrá dirigirse a la Autoridad de Control competente para presentar la reclamación que considere oportuna.

Con envío del formulario de recogida de datos usted acepta la política de privacidad de GENYCA INNOVA SL

 

  1. ACEPTACIÓN DE LAS BASES DE ESTE CONCURSO

La participación en el concurso supone la aceptación de los términos y condiciones detallados en las presentes bases y la sumisión expresa de las decisiones interpretativas que de las mismas efectúe GENYCA.

Extracción de ADN

1. INTRODUCCIÓN

Las características de un organismo están especificadas en su información genética, la cual se establece como una secuencia de ácidos nucleicos, donde la suma total de esta secuencia es lo que conforma su genoma.

Todos los avances acaecidos en los últimos años desde el comienzo del Proyecto Genoma Humano (1990), han supuesto un gran salto en nuestro conocimiento de la genética humana y han abierto la puerta a un sinfín de aplicaciones para mejorar la vida de las personas.

Uno de los procedimientos más básico en genómica y biología molecular, es la extracción y purificación de ácidos nucléicos. Por lo tanto, es necesario establecer métodos seguros y fiables para la separación de estos componentes celulares. Para lograr este objetivo, se utilizan diversos métodos de extracción dependiendo del tipo de tejido a emplear y del posterior uso de ese material genético.

 

2. MARCO TEÓRICO

Para realizar el aislamiento de ADN genómico, existen diferentes métodos y tecnologías. Sin embargo, en todos ellos podemos diferenciar varias etapas comunes en términos generales:

  1. Obtención y clasificación de la muestra
  2. Disrupción o alteración de la membrana celular
  3. Lisis de las membranas citoplasmáticas
  4. Desproteinización y separación de contaminantes e inhibidores
  5. Recuperación y aislamiento del ADN

 

El primer paso en cualquier protocolo de extracción es la clasificación del material inicial, ya sea de origen viral, bacteriano, vegetal o animal, ya que esto condicionará el tratamiento que deberemos emplear para la obtención del material genético.

Dicho material genético está alojado en el interior de la célula procariota o en el núcleo de la célula eucariota. Por ello, el protocolo de extracción seleccionado debe permitirnos lisar la célula de forma leve a fin de causar el menor daño al ADN.

En cuanto a los mecanismos de lisis celular, podemos distinguir dos tipos: aquellos basados en la acción mecánica, como el pulverizado del tejido con hielo seco o nitrógeno líquido, o los basados en la degradación enzimática de la pared celular (si está presente) y la lisis de las membranas celulares mediante detergentes. En GENYCA empleamos en todos nuestros protocolos un choque térmico para favorecer la alteración de las membranas citoplasmáticas, acompañado de un buffer de lisis para acabar de romper dichas membranas.

Seguido a esta lisis celular, la mayoría de métodos involucran una desproteinización con el fin de purificar el ADN de posibles contaminantes o inhibidores. Este proceso lo conseguimos mediante la adición de una proteasa (Proteinasa K).

Finalmente, el material genético es precipitado y concentrado en un buffer de elución, estando ya listo para ser amplificado (PCR) y utilizado en diferentes aplicaciones y diagnósticos.

 

3. TIPOS DE MUESTRAS

Existen una gran variedad de muestras a partir de las cuales podemos obtener material genético. Por tanto, esto nos permite poder realizar pruebas genéticas a partir de prácticamente todo tipo de muestras biológicas que contengan células.

En GENYCA empleamos para nuestros estudios genéticos principalmente muestras provenientes de mucosa bucal en torundas estériles. Es la muestra más utilizada en la mayor parte de los laboratorios de análisis y diagnóstico genético, debido a su fácil extracción y a la alta tasa de éxito en la obtención del ADN.

Es también muy frecuente la utilización de muestras de sangre para la realización de nuestros estudios genéticos. En ella, encontramos los glóbulos blancos o leucocitos a partir de los cuales podemos obtener ADN.

Además de las ya mencionadas, existen una infinidad de muestras de las que podemos obtener material genético humano, algunas de las más utilizadas son:

  • Folículo capilar o raíz del cabello.
  • Tejido muscular no degradado.
  • La cabeza de los espermatozoides obtenidos a partir de muestras de semen.
  • Muestras de hueso y dientes, importantes en pruebas forenses.
  • Cepillos de dientes.
  • Uñas, siempre y cuando tengan adheridas células de la piel.

 

4. TRAS LA EXTRACCIÓN

Una vez extraído y eluido el ADN es necesario conservarlo a 4º C si no se va a utilizar de inmediato.

Tras dicha extracción, ya tenemos el material genético a partir del cual poder realizar los estudios genéticos pertinentes. Generalmente, el paso posterior a la extracción es la amplificación genética o PCR mediante la reacción en cadena de la polimerasa, esta técnica nos permite ampliar la región concreta del genoma que nos interesa para cada estudio genético. Las técnicas de post-amplificación más utilizadas son: hibridación, secuenciación, restricción enzimática, electroforesis, etc. con todas sus variantes. Las iremos describiendo en siguientes artículos.

 

5. BIBLIOGRAFÍA

 

Jesús Viñas López – Genyca